Q：培養(yǎng)基 pH 值異常
A：
? 二氧化碳分壓設(shè)置錯誤：根據(jù)培養(yǎng)基中碳酸氫鈉的濃度而增加或降低培養(yǎng)箱中二氧化碳分壓。
? 培養(yǎng)箱無二氧化碳：定期觀察二氧化碳壓力表，及時(shí)更換二氧化碳鋼瓶。
? 細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋擰得過緊：將蓋子旋松 1/4 圈，或換成透氣蓋培養(yǎng)瓶。
? 細(xì)菌、真菌污染 丟棄細(xì)胞和培養(yǎng)基。
? 培養(yǎng)基中的平衡鹽不匹配：二氧化碳平衡環(huán)境中使用以 Earle's 平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hank's 平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基。
? 碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)緩沖能力不足：加入 HEPES 緩沖液，使其終濃度為 10-25 mM。
Q：細(xì)胞生長緩慢
A：
? 培養(yǎng)基或血清改變：比較不同培養(yǎng)基中葡萄糖、氨基酸等成分有無差異；增加細(xì)胞接種密度；更換新鮮培養(yǎng)基。
? 必需生長促進(jìn)成分 ( 如 L- 谷氨酰胺或生長因子 ) 缺乏、耗盡或降解使用新鮮培養(yǎng)基或向現(xiàn)有培養(yǎng)基中添加必需成分。
? 細(xì)胞初始接種密度過低：增大細(xì)胞接種密度。
? 支原體污染：檢測培養(yǎng)物有無支原體污染，如果被污染，則棄之，或用支原體清除試劑進(jìn)行清除。
? 細(xì)胞代次過高：取用新的細(xì)胞。
? 輕度細(xì)菌或真菌污染：在添加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，如果培養(yǎng)物被污染，則棄之。
試劑儲存不當(dāng)血清應(yīng)置于-5℃至 -20℃下儲存 ；培養(yǎng)基應(yīng)置于 2-8℃下避光儲存；完全培養(yǎng)基應(yīng)置于2-8℃下避光儲存，并限在2周內(nèi)使用。
Q：細(xì)胞死亡
A：
? 胰酶消化過度：縮短胰酶消化時(shí)間或降低消化用胰酶的工作濃度。
? 細(xì)胞狀態(tài)差：取用新的細(xì)胞。
? 支原體污染：檢測培養(yǎng)物有無支原體污染，如果被污染，則棄之，或用支原體清除試劑進(jìn)行清除。
? 培養(yǎng)基中無附著因子：如采用無血清培養(yǎng)方法，應(yīng)確保其含有附著因子，或使用包被過的培養(yǎng)器皿。
? 培養(yǎng)箱中無二氧化碳：定期觀察二氧化碳壓力表，及時(shí)更換二氧化碳鋼瓶。
? 培養(yǎng)箱溫度有波動：監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度。
? 轉(zhuǎn)染試劑毒性過強(qiáng)，細(xì)胞代次過高，質(zhì)粒純度差使用低毒性的轉(zhuǎn)染試劑或在轉(zhuǎn)染后及時(shí)換液；使用低代次細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ；使用高品質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
? 細(xì)胞解凍或凍存過程中損傷大：取用新的細(xì)胞。
? 培養(yǎng)基的滲透壓不正確：檢查完全培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞可耐受的滲透壓為 260-350 mOsmol/kg，昆蟲細(xì)胞可耐受的滲透壓為 340-380 mOsmol/kg。
? 培養(yǎng)基中有毒代謝產(chǎn)物蓄積過多：更換新鮮培養(yǎng)基。
Q：條帶模糊的原因？
A：
? 電壓過高或電泳時(shí)間過長，產(chǎn)熱過多導(dǎo)致電泳緩沖液溫度升高。建議參照Trans產(chǎn)品使用說明書。
? 電泳緩沖液陳舊，建議使用新鮮的電泳緩沖液，為了獲得理想的結(jié)果建議在使用前預(yù)冷緩沖液。
? 分離膠的濃度偏低，建議使用合適的膠濃度。
? 凝膠放置時(shí)間過長，建議使用新配制的凝膠電泳。
Q： 為什么有時(shí)候帶型不整齊？
A：
? 建議點(diǎn)樣時(shí)將蛋白Marker放在泳道中間。如在凝膠兩側(cè)泳道，由于邊緣效應(yīng)、離子強(qiáng)度不均等原因，均會導(dǎo)致帶型變寬或彎曲。
? 凝膠配制不勻，凝膠內(nèi)存有氣泡，或點(diǎn)樣孔中有細(xì)碎的殘膠。
Q：電泳時(shí)蛋白Marker分離不開？
A：大多為膠濃度不合適，要在推薦的凝膠濃度范圍內(nèi)使用。此外，比較陳舊的凝膠和緩沖液也會造成電泳效果不好。
Q：預(yù)染Marker電泳后清晰，但是轉(zhuǎn)膜后顏色很淺？
A：
? 轉(zhuǎn)膜時(shí)一定要將膠和膜壓緊，否則條帶會在轉(zhuǎn)膜過程中丟失或變淺。
? 轉(zhuǎn)膜條件不適合，建議200 mA、2小時(shí)，或100 mA過夜轉(zhuǎn)膜。
Q：轉(zhuǎn)膜時(shí)甲醇的濃度是多少，會對轉(zhuǎn)膜造成什么影響？
A：甲醇的濃度一般推薦為15%，甲醇濃度太高易造成蛋白穿膜，轉(zhuǎn)移到濾紙上。
Q：發(fā)光液配制需要避光嗎？
A：不需要避光，但是要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后馬上進(jìn)入暗室進(jìn)行下面的操作。
Q：發(fā)光液的有效曝光時(shí)間多長？
A：發(fā)光液在2小時(shí)以內(nèi)均可以曝光，但是前30分鐘曝光能力較強(qiáng)，隨著時(shí)間的推移可適當(dāng)延長曝光時(shí)間來調(diào)節(jié)曝光強(qiáng)度。
Q：曝光后X光片背景很黑是什么原因？
A：背景很黑可能是曝光時(shí)間太長或者顯影時(shí)間過長造成的。
Q：Western Marker 曝光后雜帶很多是什么原因？
A：Marker上樣量過多或曝光時(shí)間過長，可適當(dāng)減少上樣量或曝光時(shí)間。此外，二抗的濃度過高或特異性和純度不高，也會造成雜帶較多的結(jié)果。
Q：層析柱堵塞？
A：待純化蛋白樣品中存在固體雜質(zhì)，多見于菌體裂解液直接上樣。建議對樣品微濾 (0.45 μm) 處理。
Q：目的蛋白不與介質(zhì)結(jié)合？
A：
? 目的蛋白沒有 His 標(biāo)簽，其原因可能是載體構(gòu)建有誤、表達(dá)提前終止 (C端融合表達(dá)His 標(biāo)簽)、二級翻譯起始 (N端融合表達(dá)His標(biāo)簽)等等。建議測序檢查，或嘗試更換表達(dá)載體。
? His標(biāo)簽折疊在蛋白質(zhì)內(nèi)部沒有暴露。該情況多見于包涵體蛋白在變性條件下的純化。建議充分變性蛋白，可以嘗試使用更強(qiáng)的變性劑 (如用6 M鹽酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶劑 (SDS) 或還原劑 (DTT、β-巰基乙醇) 等方法。
? 緩沖液存在問題。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介質(zhì)純化 His 標(biāo)簽蛋白時(shí)，平衡緩沖液與樣品緩沖液中的某些組分可能會干擾目的蛋白的結(jié)合。
部分組分建議濃度如下 ：
EDTA: ≤0.1 mM (建議不要使用)
DTT: ≤1 mM (不推薦使用)
β-巰基乙醇: ≤20 mM (慎用)
咪唑: ≤20 mM (因蛋白而異)
Q：洗脫液中雜蛋白多？
A：
? 洗脫條件不合適。建議使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質(zhì)最佳洗脫條件不同，需要摸索優(yōu)化。
? 雜蛋白與介質(zhì)存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入一定濃度的咪唑 (推薦濃度 : ≤20 mM，因蛋白而異)，抑制非特異性結(jié)合。
? 雜蛋白與目的蛋白存在非特異性結(jié)合。建議在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入非離子型去垢劑 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、還原劑 (β- 巰基乙醇 : ≤20 mM） 等組分。
? 目的蛋白降解。建議在低溫下純化目的蛋白，并在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑 (如 PMSF)。
? 存在表達(dá)提前終止 (C 端融合表達(dá) His 標(biāo)簽) 或二級翻譯起始 (N端融合表達(dá) His 標(biāo)簽)。建議更換表達(dá)載體。
Q：目的蛋白沒有洗脫？
A：
? 目的蛋白量太少，無法檢出。建議更換靈敏度更高的檢測方法，如用銀染法或 Western Blot 替代考馬斯亮藍(lán)染色，或優(yōu)化上游表達(dá)條件，獲得更多的目的蛋白。
? 目的蛋白沒有結(jié)合介質(zhì)。建議檢測以下全部樣品以確認(rèn)蛋白：上樣前、流出、洗滌、洗脫。
? 目的蛋白結(jié)合牢固。建議增加洗脫強(qiáng)度，如采用更高濃度的咪唑或更低的 pH 值。
Q：蛋白不表達(dá)或表達(dá)量很低？
A：
1、選擇正確的表達(dá)載體與表達(dá)菌株
? T7啟動子的載體(如pET系列載體)應(yīng)選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動子的表達(dá)載體 (如Tac啟動子的pGEX、pMAL系列表達(dá)載體) 應(yīng)選用BL21表達(dá)菌株。
? 對細(xì)胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達(dá)低、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控誘導(dǎo)的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。
? 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。
2、嘗試不同的表達(dá)載體與菌株
不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無法通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達(dá)載體。
3、表達(dá)條件的優(yōu)化
? 選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達(dá)量。
? 較高的溫度、較高的誘導(dǎo)物濃度、較長的表達(dá)時(shí)間，一般可以加快表達(dá)的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達(dá)量。但可能會降低可溶蛋白的表達(dá)量，形成包涵體。
? 細(xì)胞的生長狀態(tài)對蛋白表達(dá)有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應(yīng)在菌株的對數(shù)生長期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導(dǎo)。
Q：目的蛋白不可溶，形成包涵體？
A：
首先確認(rèn)目的蛋白是否有表達(dá)。
? 裂解菌體并離心后，通過對全菌、上清、沉淀的檢測，確認(rèn)目的蛋白是否表達(dá)，是否形成了包涵體。
? 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素有著密切關(guān)系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下，可以嘗試不同的表達(dá)載體與菌株，增強(qiáng)其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
? 目前認(rèn)為包涵體的形成是由于蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累速度過快，沒有正確折疊而聚集沉淀?？梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如降低誘導(dǎo)溫度、降低誘導(dǎo)物濃度、縮短表達(dá)時(shí)間、降低誘導(dǎo)時(shí)菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。
Q：目的蛋白大小不正確？
A：
? 蛋白的結(jié)構(gòu)對判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^加熱變性蛋白，從而準(zhǔn)確判斷蛋白分子量大小。
? 確認(rèn)蛋白表達(dá)是否完整，蛋白是否提前終止表達(dá)。
? 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確判斷分子量大小。
RNA純化常見問題解答
Q：提取過程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩(wěn)定保存。
Q：提取過程中 RNA 降解
A：
? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應(yīng)迅速用液氮處理。材料
保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長期保存，且避免反復(fù)凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴(yán)重。
? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。
? 提取用具帶來的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過 DEPC 或 NaOH 處理嚴(yán)格去除 RNase 后才可使用。
? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人
員可通過經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類污染。
Q：RNA 提取量低
A：
? 材料 RNA 含量較低：對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植
物組織) 可適當(dāng)提高起始材料的用量。
? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴(yán)
格的 1:1，否則會明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過添加適量的檸檬酸鈉來改善沉淀效果。
Q：RNA 中有基因組 DNA 污染
A：
? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
? 材料過量：增加試劑用量。
? RNA 沉淀?xiàng)l件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
Q：提取后的 RNA 樣品降解
A：
? RNA 樣品反復(fù)凍融：反復(fù)凍融會使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。
? RNA 樣品保存條件不合適：根據(jù)保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應(yīng)保存在不同的溶液中。
如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長期穩(wěn)定保存。
Q：產(chǎn)量低
A：
? 檢查細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)條件是否適合質(zhì)粒增殖。盡可能選擇高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
? 如果質(zhì)粒拷貝數(shù)低，可適當(dāng)增加收集的菌液量，但是要保證菌體可以被完全裂解。
? 如果裂解液過于粘稠，應(yīng)適當(dāng)減少菌體量。
? 培養(yǎng)時(shí)間過長或在 2-8℃保存時(shí)間過長會明顯降低產(chǎn)量，建議使用新鮮的菌液。
Q：質(zhì)粒 DNA 中有基因組 DNA 污染
A：裂解時(shí)間不宜超過 5 分鐘。
Q：影響下游酶切
A：洗滌液 WB 洗滌后應(yīng)盡量離心去除殘留的液體，待硅膠膜完全干燥后再加入洗脫緩沖液。
Q：DNA 產(chǎn)量低
A：
? 裂解不充分：減少起始材料的用量。檢查樣品中是否加入了 Proteinase K溶液。如果提取的材料為動物組織，盡量將組織切碎，并要保證材料完全浸泡在裂解液中。適當(dāng)延長裂解時(shí)間。
? 提取材料質(zhì)量不好：盡量選用新鮮材料，樣品采集后應(yīng)盡快保存在 -70℃或液氮中。DNA 的產(chǎn)量取決于材料的種類和幼嫩程度。
? 離心柱堵塞：過柱前檢查裂解液是否清亮，去除溶液中過于粘稠的不溶物。
? 洗滌溶液中未添加無水乙醇。必須在洗滌溶液中添加合適比例的無水乙醇。
? 洗脫條件不合適：洗脫液 EB 或超純水最好預(yù)先加熱至 70℃，用超純水洗脫前應(yīng)檢查其pH 值是否在 7.0-8.5 之間，如 pH 值小于 7 將明顯影響洗脫效率，需調(diào)節(jié)后再進(jìn)行洗脫。洗脫液應(yīng)盡量加到離心柱的中央，在離心前室溫靜置 1 分鐘。
? DNA 斷裂或降解：避免因移液槍反復(fù)吹吸或反復(fù)凍融樣品造成的 DNA 損傷。避免在操作過程中帶入外源 DNase 污染。
Q：洗脫液顏色發(fā)黑或硅膠膜脫色 ( 動物組織或鼠尾材料 )
A：來源于組織的色素大量結(jié)合在離心柱上并與 DNA 一并洗脫：在過柱前檢查是否已加入乙醇，乙醇可防止色素與硅膠膜結(jié)合。在裂解液結(jié)合步驟可適當(dāng)加大轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間。
? RNA 污染：可在樣品材料制備過程中添加適量的 RNase A 降解 RNA。
Q：影響下游的酶切
A：
? 純化的 DNA 中有乙醇?xì)埩簦涸谙礈觳襟E中可能會帶來乙醇的殘留。加入洗脫液之前將離心柱在最大轉(zhuǎn)速下離心 2-3 分鐘徹底干燥離心柱。
? 純化的 DNA 中有鹽分殘留：采用正確的洗滌操作步驟，用不同 CB 溶液洗滌后再用 WB 洗滌。
Q：如何選擇合適的克隆載體？
A：Taq系列酶擴(kuò)增的片段，選用T載體；Pfu系列酶擴(kuò)增片段，選用Blunt系列載體，也可以加“A”后和T載體連接，但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質(zhì)粒DNA，推薦使用雙抗性載體。
Q：插入片段的量多少合適？
A：
? 片段加入量可根據(jù)片段長度不同進(jìn)行調(diào)整。 最佳插入片段DNA量：載體與片段摩爾比=1:7
? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計(jì)算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)粗定量即可)
? 片段加入量最大為4μl，即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少為0.5μl，可以補(bǔ)充無菌水以方便操作。
? 反應(yīng)溫度范圍：20-37℃，最適反應(yīng)溫度為25℃。
Q：反應(yīng)時(shí)間多長合適？
A：
? 大多數(shù)1 kb以內(nèi)的PCR產(chǎn)物室溫反應(yīng)5分鐘即可完成反應(yīng)。以下幾種情況可以延長反應(yīng)時(shí)間以獲得更理想的效果：
? 具有特殊結(jié)構(gòu)(高AT/高GC/反向重復(fù)序列)的片段：10-20分鐘。
? 膠回收片段或加"A"片段：10-15分鐘(該條件適用于3 kb以內(nèi)的片段)。
? 大于3 kb的PCR產(chǎn)物需延長至15-20分鐘。
Q：連接產(chǎn)物可以保存多久？
A：連接產(chǎn)物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周內(nèi)使用。
Q：多克隆位點(diǎn)上的酶切位點(diǎn)切不開？
A：篩選到的克隆來源于模板質(zhì)粒而不是連接產(chǎn)物。推薦使用雙抗載體，篩選時(shí)使用模板質(zhì)粒不具有的抗性。
Q：克隆數(shù)少或陽性率低？
A：
? 影響克隆數(shù)目和克隆效率的因素有許多，如感受態(tài)細(xì)胞效率、插入片段質(zhì)量、基因結(jié)構(gòu)、插入片段長度、插入片段和載體的比例等。如發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)少或克隆效率低，可嘗試下列方法：
? 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率對克隆數(shù)有重要影響，轉(zhuǎn)化效率高低與連接產(chǎn)物克隆數(shù)的多少不呈線性關(guān)系。假設(shè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為1×109 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)為1000；轉(zhuǎn)化效率為1×108 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數(shù)并不是100，而是低于100。為保證克隆數(shù)，請選用高轉(zhuǎn)化效率的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。
? 使用新鮮的PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物于2-8℃保存，1-2天內(nèi)使用。對于膠回收產(chǎn)物，應(yīng)盡量縮短紫外照射時(shí)間并適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間 (10-15分鐘)。
? 目的片段濃度極低時(shí)，進(jìn)行濃縮，以保證反應(yīng)時(shí)分子碰撞機(jī)率。
? 毒基因：使用Trans10感受態(tài)細(xì)胞。
? 具有特殊結(jié)構(gòu) (高AT/高GC/反向重復(fù)序列) 的基因：適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間至10-20分鐘。
Q：PCR鑒定重組子失敗？
A：當(dāng)用通用引物鑒定重組子，沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，又沒有載體自連帶，說明PCR失敗。重新優(yōu)化PCR條件或提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒作模板擴(kuò)增或酶切鑒定包含重組子的克隆。
Q：重組克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”？
A：插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框，或插入片段太短 ，這種情況下克隆呈現(xiàn)淡藍(lán)色或“Fish eye”，可正常鑒定。
Q：電泳條帶模糊?
A：
? 電泳緩沖液緩沖能力差。 電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA條帶遷移的現(xiàn)象。
? 電壓過高，電泳時(shí)間過長。電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過20 V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃。如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA條帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太高易出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。電泳過程中由于會產(chǎn)熱，因此電泳時(shí)間長容易發(fā)生條帶模糊，特別是小片段會變得模糊。
? 凝膠放置時(shí)間太長或瓊脂糖的質(zhì)量差，導(dǎo)致DNA 條帶分辨率降低。
Q：DNA Marker 降解?
A：污染了核酸外切酶。建議用滅菌的槍頭，用后及時(shí)將管蓋擰緊。點(diǎn)樣時(shí)勿將電泳緩沖液帶入管中，建議更換槍頭。
Q：用EB瓊脂糖膠電泳不同時(shí)間會出現(xiàn)條帶亮度變化?
A：由于電泳過程中條帶與EB泳動方向相反，結(jié)合EB的量會隨時(shí)間變化，因此電泳后條帶亮度會發(fā)生變化。因此建議使用EB染膠實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。
Q：DNA Marker電泳條帶分離效果不好?
A：瓊脂糖制膠濃度不合適，導(dǎo)致分辨率降低。制膠不均勻有時(shí)也會導(dǎo)致電泳異常。建議使用新制備的凝膠，制膠時(shí)注意操作中帶來的濃度誤差。一般對于大分子量片段，低濃度膠分離效果好；對于小分子量片段，高濃度膠分離效果好。
Q：不同核酸染料對DNA Marker 遷移率的影響?
A：預(yù)加GeneFinder、GelStain、GoldView到DNA Marker中，對Marker的遷移率都有一定的影響。
Q：不酶切或酶切不完全
A:
? 酶失活或濃度過低：用已知含目的酶切位點(diǎn)的對照 DNA 測試該酶活性；酶應(yīng)貯存于 -20℃，-70℃時(shí)會凍結(jié)；避免反復(fù)凍融降低酶活；可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)加大酶
量。
? DNA 濃度不合適：推薦 50 μl 反應(yīng)體系酶切 1-2 μg DNA；DNA 過量時(shí)可適當(dāng)增加酶量。
? DNA 被抑制劑污染：與對照 DNA 樣品一起酶切，驗(yàn)證其是否被抑制；重新純化 DNA 樣品。
? DNA 可能形成超螺旋：不同酶對超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 消化效率不一樣，可適當(dāng)加大酶量。
? 識別位點(diǎn)過于接近 DNA 末端：一般在識別位點(diǎn)兩端各加 6 個保護(hù)堿基可確保酶切效率。
? 識別位點(diǎn)不存在：驗(yàn)證 DNA 序列。
? 反應(yīng)條件非最優(yōu)化：緩沖液使用不當(dāng)；按比例使用新鮮緩沖液重復(fù)實(shí)驗(yàn)；按照推薦方案進(jìn)行雙酶切或分步酶切。
? 甲基化封閉酶切位點(diǎn)：PCR 產(chǎn)物未甲基化；使用 dam-/dcm-菌株轉(zhuǎn)化。
Q：出現(xiàn)非預(yù)期帶型
A：
? 確定正確帶型：酶切產(chǎn)物與對照 DNA 樣品一起電泳，確定是未消化完的底物條帶或者是星號活性產(chǎn)生的非預(yù)期條帶。
? DNA 樣品污染：重新制備或純化樣品
? 含其它酶切位點(diǎn)：驗(yàn)證 DNA 序列
Q：DNA 電泳呈彌散帶
A：
? 酶與 DNA 結(jié)合緊密未完全解離：使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳；或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。
? 核酸酶污染：制備新的底物樣品；使用新的緩沖液和水。
? 電泳條件不合適：使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠；合適的電流電壓避免過熱。
Q：星號活性 (特異性降低或改變)
A：
? 高甘油濃度 (>5% v/v)：酶儲存液含 50% 甘油；因此酶量不超過反應(yīng)體積的10%。選擇 50 μl的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以減少反應(yīng)過程中水的蒸發(fā)而提高甘油濃度。
? 非最適緩沖液：盡可能使用推薦緩沖液，離子濃度和 pH 的改變會引起星號活性。
? 存在有機(jī)溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等)：確保樣品在制備過程中不含任何有機(jī)物，如 DNA 制備過程中可能混入的乙醇。
? 混有其它二價(jià)離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價(jià)離子
